Получение лейкоцитарного альфа-интерферона

Здравоохранение материалы / Противовирусные препараты / Получение противовирусных лекарственных препаратов / Получение лейкоцитарного альфа-интерферона

Страница 4

Операция 5. Суспензионное культивирование.

Колбы с клеточной взвесью перекрывают стерильной алюминиевой фольгой и помещают в водяную баню из магнитно-проводящего материала (пластика любого типа или оргстекла), подключенную к ультратермостату. Ультратермостат должен обеспечивать устойчивое поддержания температуры в клеточной взвеси в пределах 37,5°С. Под баней помешают магнитные мешалки, вращение которых передается стержню в культуральной колбе. При скорости вращения 100 об/мин лейкоциты не травмируются, но устойчиво поддерживаются в суспензии.

Клетки инкубируют не менее 2-х часов (биологическое время). Если возникает необходимость, продолжительность прайминга можно увеличить до 12- часов. Однако в этом случат в культуральную среду необходимо добавить 0,005 М сукцината натрия.

Стадия 3. Индукция интерферона.

Для индукции используют бактериологический стерильный вирус болезни Ньюкасла с инфекционным титром не ниже 108/мл ТЦД50 в культуре куриных фибробластов. Вирус предварительно подогревают по 37,5°С.

Операция 6. Введение вируса-интерфероногена.

Культуральные колбы вскрывают под пламенем горелки и вирусосодержащую аллантоисную жидкость переливают в суспензию из расчета 10-100 ТЦД50 на I лейкоцит. Так, при содержании лейкоцитов 25 млрд. добавляют 250 млн вируса с интерфероногеным титром 109 ТЦД50. Колбу перекрывают алюминиевой фольгой с соблюдением условий стерильности и инкубируют в течение I часа при 37,5°С.

Стадия 4. Отделение индуцированных лейкоцитов.

На стадии индукции завершают подготовительные этапы интерфероногенеза.

Для улучшения переносимости препарата, после индукции необходимо удаление культуральной жидкости неадсорбировавшихся частиц вируса-индуктора и антигенов куриной аллантоисной жидкости. Для этих целей оказалось целесообразным отделение индуцированных лейкоцитов и переведение их в среду нового состава.

Операция 7. Отделение индуцированных лейкоцитов.

Суспензию индуцированных лейкоцитов центрифугируют при 600хД 15 мин 4°С, или сепарируют в условиях стерильности. Надосадочную жидкость отбирают в отдельную емкость для обеззараживания, а осадок клеток суспендируют в питательной среде следующего состава: среда № 199 или минимальная "Игла", 3 ед/мг гепарина, 5% плазмы или сыворотки донорской крови, мономицин 50 ед/мл, рН 7,2-7,4 /среда №2/.

Стадия 5. Биосинтез

Биосинтез интерферона проводят в стационарной культуре лейкоцитов. При этом происходит весьма прочное прикрепление лейкоцитов к поверхности культурного сосуда. Оказалось, что важнейшим параметром, определявшим выход активности, при стационарном культивировании является плотность посадки, то есть количество клеток на единицу поверхности. Экспериментально установлено, что оптимальным для интерфероногенеза является плотность в 5-7 млн лейкоцитов на I см поверхности. Показательно, что при такой плотности посадки лейкоциты создают пласт толщиной в 3 клетки. Хорошему прикреплению клеток способствует нанесение на внутренние поверхности культурального сосуда гидрофобного покрытия - силикона любой марки.

Для обеспечения питательной потребности культуры совершенно достаточно 0,1 л среды №2 на I млн лейкоцитов. Основой энергетического обмена для лейкоцитов является анаэробный гликолиз. Из-за дефектности ферментных систем начальных стадий цикла Кребса, окисление глюкозы в этих клетках завершается на стадии лактата и лишь небольшое количество (в пределах 3%) подвергается дальнейшему расщеплению. Поэтому, объем воздушной фазы в культуральном сосуде мало влияет на выход активности. Однако, заполнение средой культурального сосуда, более чем на половину его объема не рекомендуется.

Указанные выше рекомендации следует использовать при составлении клеточной взвеси в конкретных условиях.

Для каждого типа культурального сосуда необходимо подобрать оптимальные соотношения количества клеток и среды №2 (сохранив и газовую фазу), учитывая выходы активности и экономичность процесса биосинтеза.

Операция 8. Стационарное культивирование индуцированных лейкоцитов.

В матрицы, со строгим соблюдением стерильности, заливают рассчитанное количество среды №2 и вводят необходимое количество лейкоцитов. Перекрывают матрицы стерильными пробками, суспензию клеток тщательно перемешивают и устанавливают матрицы в соответствующе положение (норма "ребро") на стеллажи термального помещения с температурой 37°С. Культивирование продолжают 18-20 часов. Допускается роллерное культивирование лейкоцитов на стации биосинтеза при соблюдении вышеуказанных принципов.

Операция 9. Отделение отработанных лейкоцитов.

После завершения синтеза интерферон-содержащую культуральную среду подвергают центрифугированию или сепарированию с соблюдением условий стерильности для отделения отработанных клеток.

Надосадочную жидкость собирают в стерильные бутыли емкостью –10 л. Затем, для инактивации вируса - интерфероногена в каждой бутыли доводят величину рН до 2,5 добавлением при тщательном перемешивании (пипеткой, постепенно) 20%-ного раствора соляной кислоты. Правильность доведения величины рН необходимо контролировать с помощью потенциометра любой системы. Из каждом бутыли отбирают образец (10 мл) для проведения контролей, после чего бутыль перекрывают стерильной резиновой пробкой и запечатывают, на бутыль приклеивают этикетку с указанием номера серии и даты изготовления. Перед розливом по ампулам доводят рН раствора до 7,0-6,5.