Общие принципы экспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета

Здравоохранение материалы / Экспресс диагностика особо опасных инфекций / Общие принципы экспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета

Современная иммунология исключительно многолика, а сферы применения иммунологических знаний и методов беспредельно раз­нообразны. Они используются практически во всех разделах био­логии, ветеринарии и медицины — от фундаментальных молекулярно-биологических исследовании до медико-генетического кон­сультирования и множества других сугубо практических процедур, осуществляемых растениеводами, животноводами и медиками.

И, тем не менее, особенно важным в социальном отношении и методически наиболее передовым продолжает быть тот старей­ший и неуклонно развивающейся раздел иммунологии, успехами которого обеспечивается развитие теории и осуществление прак­тики противоэпидемической работы—диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний. А методы иммунологической экспресс-диагностики имеют ключевое значение для эффек­тивного решения названных проблем и осуществления всех соот­ветствующих противоэпидемических мероприятий. Следующие ниже материалы и посвящены именно этому разделу прикладной иммунологии, его состоянию и перспективам развития.

Важнейшей предпосылкой эффективности любых противоэпи­демических мероприятий является своевременное прогнозирование и обнаружение моментов активизации тех экологических и соци­ально-экологических взаимодействий, которые составляют суще­ство эпидемических процессов. Исключительное разнообразие, свойственное последним и требующее дифференциации противо­эпидемических мероприятий, обусловлено не только самобыт­ностью каждой из существующего множества инфекционных бо­лезней. Очень большое значение имеет в этом отношении фунда­ментальное явление гетерогенности популяций, входящих в состав соответствующих экологических и социально-экологиче­ских систем микроб—жертва. Вариабильность этих весьма сложных биосоциальных факторов и условий в очень большой мере влияет на специфику того или иного этапа существования каждого эпидемического процесса. И своевременное распознавание этих особенностей, осуществляемое, как правило, с использованием иммунологических методов, обеспечивает ту дифференциацию проти­воэпидемических мероприятий, благодаря которой достигается надлежащее сочетание их эффективности и оправданности.

Активизация эпидемических процессов определяется, прежде всего, изменением соотношений между двумя основными парамет­рами экологических систем микроб—жертва, а 'именно между бо­лезнетворными потенциями возбудителей соответствующих инфек­ций и иммунологическим статусом угрожаемых контингентов в це­лом и каждого из их членов в отдельности. Соотношения между этими параметрами определяют сроки и интенсивность активиза­ции эпидемических процессов, а следовательно объем и характер противоэпидемических мероприятий. Состояние же этих парамет­ров и соотношения между ними характеризуются главным обра­зом с помощью иммуно-диагностических методов, позволяющих оценивать состояния инфицированности и иммунности, как индиви­дуумов, так и коллективов. Вполне понятно, что наибольшую цен­ность имеют экспрессные методы иммунодиагностики.

Иммунологические методы экспресс-диагностики состояний ин­фекции и иммунитета в некоторых отношениях принципиально раз­личны, но во многих других аспектах они являются практически едиными.

Методы экспресс-диагностики инфекционных заболеваний до недавнего времени развивались главным образом на основе клас­сических схем микробиологического анализа, который сводится к выделению в чистой культуре возбудителя и последующей его идентификации по биохимическим, тинкториальным, антигенным и другим характерным свойствам. Многоэтапность этих анализов обусловливает их длительность и практически исключает экспрессность, удовлетворяющую эпидемиологическую и клиническую практику. Длительность микробиологического анализа составляет, как минимум, несколько дней.

Экспресс-индикация — это своеобразная раз­ведка большой армии лабораторной диагностики. Она на­ходится на переднем крае научного поиска новых, простых, экономичных, быстрых методов индикации микробов, часть из которых в дальнейшем идет на вооружение лаборатор­ной практики и благодаря этому последняя все время со­вершенствуется.

Основные объективные требования к экспрессным методам диагностики инфекционных заболеваний сводятся к следующему:

1. получение результатов анализа в максимально короткие сроки (часы, идеально—минуты);

2. возможность проведения и завершения анализа без выделе­ния искомого микроорганизма в чистой культуре, при использо­вании только нативного материала, в крайнем случае—с привле­чением элективных биосред для быстрого накопления возбуди­телей;

3. бесспорно высокая специфичность и высокая чувствитель­ность, как предпосылки надлежащей достоверности анализа;

4. высокая производительность, простота, доступность и воспроизводимость анализов. Эти требования в равной мере приложимы и к методам экспрессной диагностики состояний иммуни­тета.

Предпочтительность использования того или иного из суще­ствующих методов экспресс-диагностики зависит от многих кон­кретных условий. Однако наиболее желательным является парал­лельное использование 2—3 методов. Такой подход значительно увеличивает надежность получаемого результата.

На ближайшие годы наибо­лее перспективными следующие направления развития экспресс-индикации микроорганизмов.

1. Энзимоиндикационное направление

, связанное с экспресс-индика­цией биохимических свойств и определением ферментатив­ного спектра микробов.

По-прежнему сохранят свою значимость исследования по разработке политропных (полисубстратных) питатель­ных сред. В нашей стране были разработаны  оригинальные политропные среды и их комбинации, кото­рые с успехом применяются в лабораторной практике.

При создании сложных поликомпонентных питательных систем необходимо исходить из различных биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Для луч­шего проявления жизнедеятельности и биохимической ак­тивности патогенных и других микробов в средах необхо­димо создавать оптимальные условия для их роста и раз­множения и одновременно вводить ферментируемые суб­страты (углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты и др.) с наиболее чувствительными индикаторами, которые быстро бы регистрировали их ферментацию. В результате применения оптимальных полисубстратных сред произво­дится выделение и накопление чистой культуры микробов с одновременным определением их биохимических призна­ков.

Перспективным следует рассматривать развитие энзимоиндикационных методов, в которых субстрат с инди­катором отделен от питательной среды и фиксирован на специальном носителе. В нашей стране разработаны углеводно-бумажные дис­ки с защитной пленкой (бумажные реагенты для определе­ния дезаминаз у микробов) и их аналоги БИС (бу­мажно-индикаторные системы), углеводно-бумажные поплавки, углеводно-полимерные пленки . Все эти препараты являются весьма перспективными, они поз­воляют в течение кратчайшего срока (3—5 ч), используя общепринятые питательные среды и лабораторную посуду, определять ферментативную активность различных видов микроорганизмов.

Автономный препарат — карандаш-фермент, не имею­щий аналогов ни у нас, ни за рубежом, позволяет без при­менения питательных сред непосредственно на предметном стекле определять биохимические свойства микробов.

Полисубстратная тест-система и энзимоиндикаторная лента используются для одновременной идентификации 20 биохимических признаков у микробов. Это новые виды простых “долгоживущих” препаратов, предназначенных для быстрого и экономичного определения биохимических свойств микробов.

Электрофизический метод определения ферментатив­ной активности микробов  включает посев микробной культуры на жидкие питательные среды, содержащие пептонную воду, различные углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты с последующим ферментативным расщепле­нием исследуемых веществ и образованием различных ио­низированных продуктов распада, обнаруживаемых спе­циальной электронной аппаратурой. Результаты энзимо­индикации регистрируются через 45—60 мин с момента посева материала. Метод позволяет обнаружить и иденти­фицировать конечные продукты распада, то есть конечные мотаболиты с определением их биохимической и химичес­кой природы. Безусловно, электрофизический метод заслу­живает пристального внимания и нуждается в дальнейшем изучении и доработке.

2. Иммунологическое направление

, связанное с быстрым определением как отдельных специфических детерминант, так и с индикацией целых антигенных групп и комплексов, характеризующих роды, виды и серовары бактерий. К соб­ственно иммунологическому направлению мы относим классические иммунологические методы, основанные на использовании естественных реагентов. Реакции преципи­тации в жидкости по Асколи и в геле по Оухтерлоню и Манчини (особенно их микроварианты) сохраняют свое значение как методы экспресс-индикации патогенных микробов и выявления их антигенов в различных материа­лах.

Перспективными являются рапид-системы для одновре­менной и быстрой индикации различных видов микроорга­низмов в реакциях микроагглютинации, хотя по-прежнему не решены вопросы создания оптимальных видов и наибо­лее экономичных форм таких систем. Иммунологические принципы распознавания антигенов являются весьма тон­кими, специфическими, чувствительными, с большими ин­дикационно-диагностическими возможностями. Комплексирование иммунологических принципов с физическими, хи­мическими и некоторыми другими принципами способство­вало дифференциации иммунологического направления на ряд самостоятельных направлений, которые приводятся ниже.

3. Иммунофизическое направление

, использующее раз­личные по природе, форме и величине виды мелкодисперсных носителей (сорбентов) антигенов и антител, способ­ствующих повышению чувствительности комплексных им­мунологических методов.

Реакции пассивной гемагглютинации и их модифи­кации связаны с использованием эритроцитарных диагно­стических препаратов. Эритроцитарную диагностику с успехом применяются для ускоренного обнаружения и идентификации как патогенных, так и условно-патоген­ных микроорганизмов (например, возбудителей туляремии, бруцеллеза, сальмонеллеза  и др.) в различных патоло­гических материалах, получаемых от больных, и в объек­тах внешней среды. Реакции с эритроцитарными диагностикумами являются весьма чувствительными, и в этом отношении часто превосходят другие серологические реак­ции. Они введены в официальные инструкции по экспресс-индикации бактериальных агентов в элементах внешней среды и в материалах, полученных от пораженных людей и животных.

Одновременно продолжаются поиски новых носителей антигенов и антител, которые были бы безантигенными, стабильными, не разрушающимися при длительном хране­нии, а применяемые реакции — простыми по технике по­становки (например, стекольные тесты) и исследования с их помощью — экономичными.

Совершенствуются реакции с применением цветных целлюлозных частиц в качестве носителей антигенов и ан­тител. Положительными свойствами такого рода пре­паратов являются: 1) отсутствие собственной антигенности; 2) стабильность при длительном хранении; 3) демонстративность и простота техники постановки реакции, обычно на предметном стекле; 4) высокая скорость про­хождения реакции; 5) экономичность.

Кроме того, полезным и оправданным считаем поиск новых носителей антигенов и антител. В этом отношении перспективными являются ионообменные смолы, латексы, целлюлоза и ее производные и ряд других веществ, кото­рые могут способствовать повышению чувствительности серологических реакций.

4. Иммунохимическое направление

, связанное с использованием разнообразных комплексных соединений специ­фических антител или антигенов с химическими вещества­ми. Присоединенные химические вещества придают им но­вые феноменологические способности и свойства, тем са­мым, расширяя возможности экспресс-индикации микроб­ных агентов в частности и лабораторного анализа вообще.

Большую популярность и практическую значимость приобрели методы быстрого иммунофлуоресцентного ана­лиза (прямой, непрямой, антикомплементарный), которые ныне официально используются как методы экспрессной индикации и быстрого определения микроорганизмов.

Дальнейшее развитие весьма перспективного иммунохимического направления во многом зависит от химиков, которые должны разработать достаточно яркие новые красители, вступающие в соединения со специфическими антителами и антигенами. В результате могут быть полу­чены препараты с новыми феноменологическими свойства­ми, позволяющими проводить экспресс-индикацию микроб­ных культур и отдельных клеток с помощью широко рас­пространенных микроскопических устройств (типа МБИ различных марок).

5. Иммуноферментное направление

, интенсивно разви­вающееся в последние годы. Разработаны прямой, непря­мой, антикомплементарный и другие методы быстрого об­наружения микробов путем использования иммуноэнзимологического принципа; предложены новые виды фермен­тов, а также разнообразные виды хромогенных субстратов. Данное направление является весьма перспективным, раз­витие его может привести в ближайшие годы к появлению новых методов экспресс-индикации микроорганизмов.

6. Иммуноэлектрофоретическое направление

успешно развивается с конца 50-х годов. Разработаны многочис­ленные методы иммуноэлектрофореза. Однако для целей экспресс-индикации микробов чаще прибегают к встречно­му иммуноэлектрофорезу. Применение новых химических красителей, ферментной или радиоактивной метки позво­лит резко повысить чувствительность метода иммуноэлектропреципитации.

7. Иммунорадиологическое направление

связано с ис­пользованием разнообразных конъюгатов специфических антител или антигенов, соединенных с радиоактивными ве­ществами, которые придают им новые феноменологические свойства и способности, расширяя возможности экспресс-индикационного метода. Весьма перспективно дальнейшее развитие иммунорадиологического направления, так как оно несомненно приведет к созданию новых, простых ме­тодов экспресс-индикации микроорганизмов.

8. Микроцитологическое направление

быстрого цитоморфо-логического анализа связано с использованием светлопольной, фазово-контрастной или люминесцентной ми­кроскопии бактериологических мазковых препаратов, обра­ботанных и окрашенных красителями, позволяющими бы­стро идентифицировать микроорганизмы по их морфоло­гии и специфическим структурным элементам микробной клетки. Исследованию подвергают как нативный (гной, мокрота, моча, СМЖ, различные экссудаты и др.), так и обогащенный (например, центрифугированием, фильтрова­нием и другими методами) патологический материал.

9. Бактериологическое направление

связано с ускорен­ным выделением и накоплением бактериальных популяций патогенных, условно-патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Оно основано на использовании оп­тимальных ростовых питательных сред, содержащих необ­ходимые биостимуляторы, для ускоренного получения бак­териальной культуры и частичной их идентификации по совокупности культуральных признаков.

10. Фагодиагностическое направление

, которое преду­сматривает, с одной стороны, идентификацию микробов с помощью специфических индикаторных бактериофагов, а с другой,— обнаружение и индикацию специфических фагов в патологическом и другом материалах с помощью инди­каторных микробных культур.

Ускоренная фагодиагностика в ряде случаев является необходимым и полезным методом, позволяющим значи­тельно сократить сроки исследований и установить природу возбудителя даже в тех случаях, когда другими методами, в виду его изменчивости или загрязненности материала, он остается нераспознанным.

11. Биологическое направление

, связанное с изучением токсических и агрессивных свойств патогенных микроорга­низмов. Биологические методы осуществляются на одно­клеточных организмах, на культурах клеток, куриных эм­брионах, а также на здоровых, а еще лучше специально подготовленных лабораторных животных. Эти методы бо­лее трудоемкие и менее точные по сравнению с другими.

12. Физико-химическое направление

. Это направление связано с использованием сравнительно быстрых, но в то же время и достаточно сложных по аппаратурному оформ­лению методов. Сюда входят методы изучения бактериаль­ных популяций и их экстрактов с помощью хроматографии (газожидкостная и др.), спектроскопии (инфракрасной, ультрафиолетовой и др.), резистографии в отношении раз­личных антибиотических, химических и лекарственных ве­ществ, а также методы температурной и кислотной агре­гации, коагуляции микробных суспензий и их токсинов.

13. Рецепторное и генетическое направления

бы­строй индикации патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Методы, основанные на этих принципах, только начинают развиваться. Так, с помощью целлюлозно-глобулинового или эритроцитарно-глобулинового диагностикумов быстро обнаруживают патогенный стафило­кокк, содержащий белок А, а путем гомологии неизвестных нуклеиновых кислот с известными нуклеиновыми кислота­ми устанавливают вид патогена.

14. Комплексное направление

ускоренной идентифика­ции патогенных и санитарно-показательных микроорганиз­мов, использующее методы экспресс-индикации, основан­ные на интеграции различных принципов, связано с разра­боткой и созданием индикаторных тест-систем, позволяю­щих в течение короткого срока и с минимальными затра­тами на анализ определить комплекс основных признаков патогена или санитарно-показательного представителя, достаточных для его идентификации до рода, вида и даже типа.

15. Направления, связанные с разработкой новых прин­ципов микробиологического анализа

. Вполне вероятно, и мы вправе ожидать в ближайшие 5—10 лет появления но­вых идей, подходов и принципов в микробиологической нау­ке и смежных с ней областях. Открытие новых видов рецепторной, иммунологической и генетической специфично­сти у микробов позволит создать новые и возможно более совершенные методы быстрой идентификации микроорга­низмов.

Основные пути развития экспресс-индикации микро­организмов на ближайшие годы:

1) создание и конструирование новых препаратов, спо­собствующих ускорению и удешевлению исследований, по­вышению эффективности лабораторной диагностики ин­фекций и индикации патогенных и других микроорганиз­мов. На этом пути предстоит сделать очень многое, по­скольку общепринятые диагностические препараты в зна­чительной степени исчерпали свои потенциальные возмож­ности;

2) разработка новых более чувствительных, простых методов лабораторного анализа.

3) разработка комплексных методов и видов исследо­ваний. Будет продолжаться дальнейшая интеграция мето­дов и видов исследований, имеющих разные принципы дей­ствия, лежащие в их основе;

4) создание новых схем исследований. Поскольку ла­бораторная диагностика инфекционных болезней, а также экспресс-индикация, хотя и в меньшей степени, связаны с изучением комплекса различных свойств и особенностей микроорганизмов с использованием обычно разнообразных методов и приемов, основанных на различных принципах, то создание новых схем исследований с применением но­вых методов является объективной реальностью и важной задачей, вытекающей из существа самого процесса разви­тия микробиологического анализа;

5) разработка и создание новых методов регистрации и учета результатов экспресс-индикационных и лаборатор­ных исследований.

6) разработка новой микроминиатюрной лабораторной посуды, аппаратуры и приборов для исследований;

7) автоматизация и компьютеризация исследований.

В современных условиях эти вопросы должны решаться комплексно.

Таким образом, рассмотренные основные направления и пути развития экспресс-индикации микроорганизмов в период современного научно-технического прогресса есте­ственных наук безусловно получат дальнейшее ускоренное развитие, а микробиологическая лабораторная практика обогатится новыми быстрыми методами индикации микро­бов.